PRINCIPALES TINCIONES HEMATOLOGICAS.
MECANISMOS DE TINCION
MÉTODOS DE COLORACIÓN:
Se llama colorante a la sustancia capaz de absorber determinadas longitudes de onda del espectro visible.
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Los colorantes son sustancias que se fijan en otras sustancias y las dotan de color de manera estable ante factores físicos/químicos como por ejemplo: luz, lavados, agentes oxidantes, etc. Se utilizan para diferenciar fácilmente la morfología y estructura de los organismos en observación.
Los colorantes modifican el índice de refracción de las sustancias que colorean.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucléicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.
Coloración. La tinción o coloración se efectúa con dos propósitos:
- La coloración rutinaria trata de posibilitar el estudio morfológico o estructural, sin que se pueda obtener mayor información sobre la naturaleza química de las estructuras observadas.
- La histoquímica utiliza métodos tendientes a identificar a un determinado tipo de molécula o sustancia, visualizándola microscópicamente.
La mayoría de los colorantes citológicos o histológicos son de naturaleza orgánica y aromáticos. Se reconocen dos tipos de colorantes: básicos y ácidos. En los colorantes básicos el grupo que imparte el color (grupo cromóforo) es básico (catiónico). Por ejemplo, el azul de metileno es el clorhidrato de tetrametiltionina, en el que la parte ácida (ClH) es incolora. Algunas veces los dos componentes de la sal son cromóforos, como en el caso del eosinato de azul de metileno. El grupo por medio del cual el colorante se combina con el tejido se designa auxocromo. La coloración rutinaria más empleada es la combinación de un colorante básico (hematoxilina) y uno ácido (eosina). Característicamente la hematoxilina colorea los núcleos y el retículo endoplasmático rugoso y la eosina colorea los citoplasmas y la mayoría de los elementos fibrilares del espacio intercelular. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.
También los colorantes pueden ser suministrados en forma de soluciones. La apariencia externa de un colorante no es un criterio para su calidad o intensidad, ya que puede variar en función de la temperatura, PH, humedad, etc. Los colorantes son muy sensibles a las influencias ambientales del aire, luz, temperatura excesiva. Con el oxígeno del aire puede producirse una oxidación, lo que puede ocurrir también con la luz. Por todo esto los colorantes deben ser almacenados en lugares obscuros, fríos y secos. El proceso de tinción empieza con el paso de fijación con metanol que resulta en la adherencia de las proteínas celulares al portaobjetos y evita que las células se deslaven durante los pasos subsecuentes. La fijación adicional se realiza cuando el frotis se cubre con el colorante de Wright; la tinción efectiva se da con la adición de un amortiguador al colorante que da lugar a la ionización de los colorantes. Después se enjuaga con agua destilada y se deja secar al aire.
Metacromasia. Una solución diluida de un colorante tiazínico es azul, debido a que se encuentra como monómero. Si la solucione es concentrada, el colorante se agrega y forma polímeros, por lo que el color vira al rojo. Así, un colorante tiazínico puede presentar distinto color, de acuerdo con el estado de agregación de las moléculas y es precisamente este estado de agregación, que puede ser modificado por los componentes tisulares, el que produce la metacromasia. Es el fenómeno por el cual un colorante (por ejemplo Azul de Toluidina o la tionina) cambia de color tras reaccionar con un componente textural. Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES, la molécula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorción son diferentes de las propiedades de las moléculas individuales. Se interpreta que la metacromasia refleja gran cantidad de cargas aniónicas muy cercanas unas a otras en el tejido, una situación prevalente en la sustancia fundamental del cartílago y en los gránulos de los mastocitos, el Azul de Toluidina tiñe a estos de color púrpura. Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados Cromotropos, son principalmente los glucosaminoglucanos sulfatados y las nucleoproteínas.
TINCION DE GIEMSA.
Mecanismo de la coloración de Giemsa: El azur B con la eosina, unidos a nivel de la cromatina del plasmodio o de otros protozoarios, dan un color rojo al nucleo; el citoplsma toma el color del azul de metileno: es el efecto Romanowsky en sentido estricto. Los autores contemporáneos amplian el termino “efecto” al color violeta rojizo nuclear de las células sanguíneas y de medula osea teñidas con el colorante de Giemsa. Este color violeta rojizo de los nucleos de estas células se debe a la unión del Azur 1 con los radicales fosfato del ADN.
Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación; así como colorantes eosina Y o eosina B. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico. La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas. Romanowsky (Wrigth, Giemsa, Leishman, May Grünwald) son mezclas de 2 colorantes primarios, el Azul de metileno y la eosina. El azul de metileno (color azul), es un colorante básico, en las células se une a sustancias ácidas que se tiñen de color azul. La eosina es un colorante ácido, en las células se unen a las proteínas básicas que se observan de color naranja. Durante el proceso de maduración de los colorantes de Romanowsky, el azul de metileno se oxida dando lugar a colorantes secundarios. Los más importantes son los Azures de metileno, de color azul brillante, que son también colorantes metacromáticos. Cuando las moléculas de un colorante metacromático estan desordenados en una solución, el color observado es el natural (azul), sin embargo, cuando dichas moléculas se ordenan en el espacio muy juntas unas de otras forman un color distinto (Rojo). Este método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma). La tinción de Giemsa emplea como colorante fundamental, una mezcla de tiacínicos catódicos, como el azur A, B y azul de metileno, que colorean el núcleo, mientras que la eosina es para la coloración citoplasmática, estas sustancias están disueltas en alcohol metílico. Su fundamento está en la disociación controlada de las sales de eosinato, que ocurre por la mezcla o disolución de Giemsa en agua destilada (precipitación) reacción estable por 4 horas; la eosina así liberada colorea el componente extracelular y determinadas estructuras acidófilas; y los derivados de azur, las estructuras de carácter basófilo. La cromatina nuclear adopta la tinción azul violácea algo distinta a la habitual para los colorantes tiacínicos y que recibe la denominación de efecto Giemsa. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.
Resultados e interpretación:
Los eritrocitos se tiñen de salmón
Las plaquetas de violeta
Los núcleos de los leucocitos de violeta o purpura
El citoplasma de los leucocitos es ligeramente naranja a salmón.
El método de Wright solo se puede aplicar a frotis delgados mientras que en Giemsa se pueden usar frotis delgados y frotis de gota gruesa omitiendo el paso de fijación con alcohol metílico para la observación microscópica de parasitos.
TINCIÓN DE WRIGHT.
La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky.
Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B.
La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucléicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico. La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas. La naturaleza ácida o básica de las estructuras celulares determina su avidez por los componentes del colorante policromático de Wright; es así como los ácidos nucléicos se tiñen con azul B que es el básico y la hemoglobina con la eosina Y que es ácida. Otras estructuras se tiñen por una combinación de ambos y se denominan neutrófilas.
Una tinción satisfactoria debe dar los siguientes resultados:
Glóbulos Rojos: rojo.
Neutrófilos: cromatina púrpura oscuro, citoplasma rosa pálido y gránulos lila.
Eosinófilos: cromatina púrpura oscuro, citoplasma azul pálido y gránulos rojo brillante.
Basófilos: cromatina púrpura oscuro, gránulos azul oscuro.
Linfocitos: cromatina púrpura oscuro, citoplasma azul cielo.
Monocitos: cromatina púrpura medio, citoplasma azul grisáceo y gránulos lila
Plaquetas: centrómero violeta o púrpura, hialómero azul claro.
Causas de error en la tinción del frotis sanguíneo.
Una extensión excesivamente azul (basófila).
Extensión gruesa.
Lavado insuficiente.
Tiempo tinción excesivamente prolongado.
Empleo de colorante excesivamente alcalino
Una coloración excesivamente rosada (acidófila).
Exceso de buffer acido.
Empleo de colorante excesivamente ácido (por deterioro y contaminación).
TINCION DE MAY GRUNWALD -GIEMSA (Tinción panóptica).
El empleo combinado de los colorantes May Grunwald y Giemsa se conoce con el nombre de tinción panóptica de May Grunwald Giemsa. Se basa en el uso de soluciones preparadas a base de colorantes de acentuado poder policromatófilo y metacromático.
Fundamento: Se basa en el agregado de la solución de May Grunwald formada por eosinato de azul de metileno en alcohol metílico , la que fija el extendido y tiene afinidad por los citoplasmas. Luego se agrega el colorante Giemsa diluido (en el momento de realizarse la coloración). Esta constituido por Azures que son derivados por oxidación del azul de metileno. Tiene afinidad por los núcleos y ciertas granulaciones. La eosina es un colorante ácido por lo tanto tiñe los componentes acidófilos de las células.El azul de metileno es un colorante básico por lo tanto se une a las fracciones basófilas. Es importante respetar las condiciones de la coloración ya que variaciones de pH pueden alterarla. En esta coloración se trabaja a pH neutro o ligeramente acido. Si se trabaja a pH ácido, habrá mayor cantidad de sustancias cargadas positivamente y se absorberá mayor cantidad de eosina. Los extendidos adquieren una tonalidad rojiza. Si el pH es muy básico, habrá mayor fijación de azul de metileno y se exagerarán los colores azules. El proceso de tinción empieza con la fijación con metanol cuya acción es fijar la película de sangre por precipitación y adherencia de las proteínas celulares y del plasma al portaobjetos de vidrio. La tinción efectiva se inicia con la adición de un amortiguador al colorante lo que da lugar a su ionización. La eosina y el azul de metileno son sensibles a cambios de pH de las diferentes estructuras celulares. El reactivo en medio acuoso tiene la acción de diferenciar tiñiendo. La solución de May-Grünwald, que contiene el colorante ániónico eosina y el colorante catiónico azul de metileno ambos disueltos en metanol. La solución de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de productos de la oxidación de este último tales como el azur A, el azur B, el violeta de metilo y el azul de metilo. Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se mantienen en solución de alcohol metílico, pero al añadir agua se ionizan y se unen selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles. Los componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen selectivamente a los tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul. Estos componentes son llamados basófilos: (ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas en ARN). Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen selectivamente al tinte ácido eosina, tiñendose en variados tonos de naranja y rojo. A estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el caso de la hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de los granulocitos eosinófilos.
Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes se denominan neutrófilos y se tiñen en variados tonos de violeta.
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TECNICAS COMPLETAS DE TINCIONES HEMATOLOGICAS
EOSINA-AZUL DE METILENO EN SOLUCION SEGUN WRIGHT (MERCK)
Microscopia. Producto para diagnóstico in vitro. Tinción de frotis sanguineos, de médula ósea y de material citológico clínico.
Principio.
El típico color de los núcleos celulares, mayoritarianente rojo púrpura, se basa en la interacción molecular entre eosina y un complejo azur B - ADN. Ambos colorantes forman el complejo. La intensidad de la coloración depende del contenido de azur B y de la relación entre azur B y eosina amarilla. El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores como el valor del pH de la solución y de la solución tampón, las substancias tampón (amortiguadores), el tiempo de tinción y la fijación.
Material
Frotis de sangre y de médula ósea secados al aire. Material clínico como sedimento urinario, esputo, FNAB (biopsia por aspiración con aguja fina), imprints, soluciones de lavado.
Reactivos
Eosina-azul de metileno en solucion según Wright
tampón según Weise pH 6.4
Eosina-azul de metileno según Wright 25 g
Preparación
1. Solución tampón según Weise Buffer de Fosfato pH 6.4+- 0.1 a 25°C. Para usarse en la tinción.
PREPARACION DEL BUFFER PH 6.4
Disolver:
Na2HPO4 x 2 H2O 0,2 g/l
KH2PO4 0,8 g/l
Aforar en 1000 ml de agua destilada o cambiar pH para tinciones en función del resultado y tipo de tincion deseado.
2. Solución de Wright diluida para tinción manual.
Añadir 17 partes en ml de solucion tampon a 3 partes en ml de solución de eosina-azul de metileno según Wright.
3. Preparación de la solución de eosina-azul de metileno según Wright a partir de colorante en polvo.
Disolver 0,25 g de eosina-azul de metileno según Wright en 100 ml de metanol, triturar cuidadosamente durante 2-3 minutos o hasta que se haya disuelto el colorante, mezclar antes del uso.
Técnica:
Frotis secados al aire
Banco de tinción.
Solución primaria de Wright 1 min
Añadir solución tampón (1 ml), mezclar, teñir 4 min
Enjuagar con agua destilada
Secar
Cubeta de tinción.
Solución primaria de Wright 3 min
Solución de Wright diluida 6 min
Lavar con agua destilada x 10 seg
Secar
AZUR-EOSINA-AZUL DE METILENO EN SOLUCION SEGÚN GIEMSA (MERCK)
Producto para diagnóstico in vitro. Tinción de frotis sanguíneos y de médula ósea; cortes de parafina de material citológico clínico.
Principio
El típico color de los núcleos celulares en hematología es mayoritariamente rojo púrpura, se basa en la interacción molecular entre eosina y un complejo azur B – ADN. Ambos colorantes forman el complejo. La intensidad de la coloración depende del contenido de azur B y de la relación entre azur B y eosina amarilla. El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores como el valor del pH de la solución y de la solución tampón, las substancias tampón (amortiguadores), el tiempo de tinción y la fijación.
En histología, durante el pretratamiento se procesan los diferentes componentes celulares. Los núcleos celulares se muestran en diversas tonalidades de azul. Los componentes acidófilos se representan en diversas tonalidades de rojo.
Material
Sangre secada al aire y frotis de médula ósea, cortes de parafina, material clínico en citología, como sedimento urinario, esputo, FNAB (biopsia por aspiración con aguja fina), imprints, soluciones de lavado.
Reactivos
Azur-eosina-azul de metileno en solución según Giemsa
Metanol
Glicerina
tampón según Weise pH 6.4
Azur-eosina-azul de metileno según Giemsa 25 g,
Eosina-azul de metileno en solución según Wright
Preparación
1. Solución tampón
Buffer de Fosfato pH 6.4+- 0.1 a 25°C. Para usarse en la tinción
PREPARACION DEL BUFFER PH 6.4
Disolver:
Na2HPO4 x 2 H2O 0,2 g/l
KH2PO4 0,8 g/l
Aforar a 1000 ml con agua destilada o cambiar pH en función del resultado y tipo de tinción deseado.
2. Solución de Giemsa diluida para tinción manual.
Diluir 1 parte en ml de azur-eosina-azul de metileno en solución según Giemsa con 9 partes en ml de solución tampón, mezclar bien, solucion estable 4 horas.
3. Azur-eosina-azul de metileno en solución según Giemsa a partir de colorante
Disolver 0,76 g de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa en 50 ml de glicerina, triturar hasta disolver, añadir 50 ml de metanol.
Técnica
Frotis secados al aire
Cubeta de tinción.
Solución primaria de Wright 3-5 min
Lavar 10 segundos
Solución diluida de Giemsa 15-20 min
Lavar con agua destilada x 15 seg
Secar
(tecnica utilizada en todas las microfotografias).
PREPARACION DE LIQUIDOS CON MATERIAL CITOLOGICO: CEFALORRAQUIDEO, SOLUCIONES DE LAVADO, LIQUIDOS SEROSOS, ETC.
El contenido de proteinas en liquidos con celulas es inferior al necesario para que la fijacion ocurra por si sola. Se requiere un procedimiento auxiliar para la fijacion y tincion completa de los mismos.
Procedimiento
1. Centrifugar 5 min a 2500 rpm.
2. Eliminar todo el sobrenadante.
3. Agregar 2 gotas de albumina al 25 % ( o plasma citratado). Resuspender.
4. Realizar extension y teñir con la misma tecnica que las extensiones sanguineas.
ANEXO: SOLUCIONES AMORTIGUADORAS PARA TINCIONES HEMATOLOGICAS
tampón según Weise pH 6,4
tampón según Weise pH 6,8
tampón según Weise pH 7,2
Producto para diagnóstico in vitro. Según MERCK .Tampón según Weise para microscopia
tampón de fosfato para preparación de soluciones tampón según Weise para tinciones de frotis sanguíneos
Principio
En las tinciones de frotis sanguineos es necesario usar agua destilada neutra para conseguir tinciones reproducibles. Para preparar la solución de Giemsa diluida y para enjuagar preparados teñidos debe utilizarse agua de esta calidad. El agua recién destilada puede estabilizarse añadiendo un tampón (amortiguador). La mezcla tampón según Weise ha dado buenos resultados. El valor de pH deseado se ajusta automáticamente añadiendo el correspondiente tampón.
Las variaciones del valor del pH son causadas por una parte por la entrada de anhídrido carbónico del aire y por otra a posibles restos de productos de limpieza en los recipientes. El agua destilada ácida provoca una tinción rojiza y el agua destilada alcalina una tinción azulada.
Con las soluciones tampón pH 6,4, 6,8 o 7,2 según Weise se evitan con seguridad tinciones defectuosas. Con solución tampon según Weise pH 6.4 se obtiene una tinción en la que los eritrocitos están fuertemente teñidos de anaranjado, las células nucleadas están teñidas de violeta rojizo, con solución tampón según Weise 6,8 los eritrocitos están teñidos de anaranjado y las células nucleadas están teñidas de violeta rojizo intenso, con solución tampón según Weise pH7,2 los eritrocitos aparecen grisáceos y las células nucleadas están teñidas de violeta rojizo todavía más intenso. La elección del correspondiente tampón según Weise depende de la tecnica requerida.
Aplicación
Las soluciones tampón de fosfato se utilizan para las tinciones de Giemsa, May-Grünwald, la combinación de Giemsa-May-Grünwald (Tinción de Pappenheim), Wright, Leishman y hemoparasitos.
Material
Frotis fijados de sangre y de médula ósea, o frotis de material citológico clínico, como esputo, FNAB (biopsia por aspiracion con aguja fina), líquidos de lavado, imprints, efusiones, exsudados.
Reactivos
tampon según Weise pH 6,4 tampón según Weise pH 6,8
tampon según Weise pH 7,2
Preparación
Preparación de soluciones tampón pH 6,4, 6,8 ó 7,2.
Disolver las sales tampón en 1000 ml de agua recién destilada, si es necesario agitando. La solución tampón, bien cerrada en un frasco de vidrio, se mantiene estable como mínimo durante 4 semanas.
Diluir para:
Solucion amortiguadora ph 6.4
Na2HPO4 x 2 H2O 0,2 g/l
KH2PO4 0,8 g/l
Solucion amortiguadora ph 6.8
Na2HPO4 x 2 H2O 0,47 g/l
KH2PO4 0,47 g/l
Solucion amortiguadora ph 7.2
Na2HPO4 x 2 H2O 0,63 g/l
KH2PO4 0,31 g/l
